引言

在饱和结合实验中，您需要改变放射性配体的浓度并测量结合情况。目的是确定 Kd（平衡时与一半受体位点结合的配体浓度）和 Bmax（结合位点的最大数量）。

配体不仅与受体位点结合，还与非特异性位点结合。处理非特异性结合有三种方法。

•减去非特异性，只分析特异性结合。请继续阅读这种方法。

•只分析总结合，从总结合曲线的形状推断非特异性结合的量。了解更多。

•一次性分析总结合和非特异性结合。了解更多。

步骤

创建 XY 数据表。在 X 列输入放射性配体浓度，在 Y 列输入特异性结合。如果有多个实验条件，则将第一个条件放入 A 列，第二个条件放入 B 列，等等。

然后使用 "移除基线"（Remove Baseline）分析从 A 列中减去 B 列，创建一个包含特异性结合的新结果表。

在特异性结合表中点击分析，选择非线性回归，选择饱和结合方程面板，然后选择单位点特异性结合。

模型

Y = Bmax*X/(Kd + X)

解读参数

Bmax是最大特异性结合力，单位与 Y 相同。它是对极高浓度放射性配体的特异性结合力的推断，因此其值几乎总是高于实验中测得的任何特异性结合力。

Kd是平衡解离常数，单位与 X 相同，是在平衡时达到半最大结合所需的放射性配体浓度。

创建 Scatchard 图

在非线性回归出现之前，研究人员必须将曲线数据转化为直线，这样才能用线性回归进行分析。其中一种方法是使用斯卡查德图，它可以绘制特异性结合与特异性结合与游离放射性配体浓度之比。

如果您绘制了斯卡特卡德图，请仅用于显示数据。人类视网膜和视觉皮层的进化是为了检测边缘（直线），而不是直角双曲线，因此用这种方式显示数据会有所帮助。Scatchard 图通常作为饱和结合曲线的插页显示。当您想显示 Bmax 或 Kd 的变化时，它们尤其有用。

不要使用线性回归线的斜率和截距来确定 Bmax 和 Kd 的值。如果这样做，就无法得到最准确的 Bmax 和 Kd 值。问题在于转换会扭曲实验误差，因此斯卡查德图上的数据不符合线性回归的假设。使用非线性回归可以获得最准确的 Kd 和 Bmax 值。

要根据特异性结合数据创建斯卡查德图，请使用 Prism 的变换分析，并从生物化学和药理学变换面板中选择斯卡查德变换。

要创建与非线性回归拟合相对应的斯卡恰德线，请按照以下步骤操作：

1.新建一个没有子列的 XY 数据表。

2.在第 1 行输入 X=0，Y=Bmax/Kd（之前通过非线性回归确定）。

3.在第 2 行输入 X=Bmax，Y=0。同样在 X 列输入数字，而不是文本 "Bmax"。

4.注意这个数据表的名称。或许可以将其重新命名为合适的名称。

5.转到 Scatchard 图表。

6.从导航器中拖动新表格并将其拖放到图形上。

7.双击该数据集的一个新符号，弹出设置图表格式对话框。

8.选择不绘制符号，但用直线连接。

 

注意

•这不是确定 Bmax 和 Kd 的最佳方法。最好是全局结合总结合力和非特异性结合力，而不是减去计算特异性结合力。

•绘制 Scatchard 图时，必须选择 Y 轴使用的单位。有些研究者用 cpm 表示游离配体和特异性结合，因此结合/游离的比率是一个无单位的分数。虽然这很容易解读（这是放射性配体与受体结合的分数），但另一种方法是用位点/细胞或 fmol/mg 蛋白质表示特异性结合，用 nM 表示游离放射性配体浓度。虽然这使得 Y 轴难以直观解读，但却为斜率（等于-1/Kd）提供了正确的单位。

•该方程等同于表面吸收气体的朗缪尔等温线。