引言

在饱和结合实验中，改变放射性配体的浓度，并测量结合度。目的是确定Kd（平衡时结合一半受体位点的配体浓度）和Bmax（最大结合位点数）。

配体不仅结合受体位点，还结合非特异性位点。处理非特异性结合有三种方法。

•减去非特异性结合，且仅分析特异性结合。请继续阅读这种方法。

•仅分析总结合，根据总结合曲线的形状，推断非特异性结合的量。了解更多。

•同时全局分析总结合和非特异性结合。了解更多。

循序渐进

创建一张XY数据表。将放射性配体浓度输入X，将特异性结合速度输入Y。如果您有若干个实验条件，则将第一个输入A列，第二个放入B列，依此类推。

另一种替代方法是，将总结合输入到A列，将非特异性结合输入到B列。然后，使用“删除基线”分析，从A列中减去B列，以创建包含特异性结合的新结果表。

从特异性结合表中，单击分析，选择非线性回归，选择饱和结合方程窗格，然后选择 单位点特异性结

模型

Y=Bmax*X/（Kd+X）

解读参数

Bmax为最大特异性结合，采用与Y相同的单位。这是外推到极高浓度的放射性配体的特异性结合，因此，其值几乎始终高于实验测量的任何特异性结合。

Kd是平衡解离常数，采用与X相同的单位。这是处于平衡状态时，达到一半最大结合所需的放射性配体浓度。

创建Scatchard图

在非线性回归可用之前，研究者必须将曲线数据转换成直线，进而可以使用线性回归进行分析。一种方式是使用Scatchard图，该图绘制了特异性结合与特异性结合和游离放射性配体浓度的比值。

如果您创建一个Scatcahrd图，请仅使用其来显示您的数据。进化的人视网膜和视觉皮质可检测边缘（直线），而非矩形双曲线，因此，其有助于以这种方式，显示数据。Scatchard图通常可显示为饱和结合曲线的插入图。当您想显示Bmax或Kd中的变化时，它们尤其有用。

不要使用线性回归线的斜率和截距来确定Bmax和Kd的值。如果您这样做，您将不会得到最准确的Bmax和Kd值。问题在于，转换扭曲了实验误差，因此，Scatchard图上的数据不遵从线性回归的假设。使用非线性回归获得最精确的Kd和Bmax值。

如需根据特异性结合数据来创建Scatchard图，请使用Prism“转换”分析，然后从生物化学和药理学转换窗格中，选择Scatchard转换。

如需创建对应于非线性回归拟合的Scatchard线，请执行以下步骤：

1.创建没有子列的新XY数据表。

2.在第1行中，输入X=0，Y=Bmax/Kd（先前由非线性回归确定）。您需手动计算，然后输入一个数字。

3.在第2行中，输入X=Bmax、Y=0。再次将数字输入到X列中，而非输入到文本“Bmax”中。

4.请注意该数据表的名称。或许可以将其重新命名为合适的名称。

5.转至Scatchard图。

6.将新表格从导航器中拖放到图表上。

7.双击该数据集中的一个新符号，以弹出“设置图表格式”对话框。

8.选择不绘制符号，而是用一条线连接。

 

注释

•这并非确定Bmax和Kd的最佳方式。最好是全局拟合总结合和非特异性结合，而无需减去以计算特异性结合。

•绘制Scatchard图时，您必须选择您想在Y轴上使用的单位。某些研究员以cpm为单位来表示游离配体和特异性结合，因此，结合/游离比是一个无单位分数。尽管这易于解读（这是放射性配体与受体结合的分数），但另一种替代方法是，以位点/细胞或fmol/mg蛋白为单位来表示特异性结合，还以nM为单位来表示游离放射性配体浓度。尽管这使得Y轴难以直观解读，但其为斜率（其等于-1/Kd）提供了正确的单位。

•该方程相当于气体吸附在表面上的Langmuir等温线。