在饱和结合实验中,改变放射性配体的浓度,并在平衡状态下测量结合度。目的是确定Kd(平衡时结合一半受体位点的配体浓度)和Bmax(最大结合位点数)。
配体不仅结合受体位点,还结合非特异性位点。处理非特异性结合有三种方法。
•减去非特异性,然后仅分析特异性结合。
•仅分析总结合,从总结合曲线的形状推断非特异性结合的量。
•完全结合和非特异性结合全局拟合在一起。
我们推荐第三种方法(总结合与非特异性结合的整体拟合)。拟合特异性结合所存在的问题是您必须做出一些假设,以便从总结合中减去非特定性结合,且您拟合的结果值并非真正的数据。我们建议您尽可能拟合您实际收集的数据,并避免创建衍生的数据集(在本示例中是特异性结合)。
总结合的拟合只需要较少数据,因此可以节省实验时间和金钱。但大多数人认为,仅仅根据结合曲线的形状定义非特异性结合而不对非特异性结合进行实验测量属于不恰当的做法。仅拟合总结合的优点之一是,即使大部分配体已经结合,也可以推导出拟合这些数据的方程,从而导致配体耗尽(游离浓度远远低于添加的浓度)。
Prism提供拟合单位点或双位点的模型。可以使用“比较”选项卡中的选项来比较这两个拟合度。当比较单位点和双位点模型的拟合度时,使用常识和统计数据。不要接受双位点的模型,如果其中一个位点只占总数的很小一部分,或如果其Kd超出了在实验所用放射性配体的浓度范围。