Please enable JavaScript to view this site.

引言

最常见的酶动力学实验是改变底物浓度和测量酶的速度。目标是确定酶的Km(产生一半最大速度的底物浓度)和Vmax(最大速度)。如果您的目标是确定转换率kcat,而非Vmax,请使用方程的替代版本。

逐步                                                                

创建一张XY数据表。将底物浓度输入X,将酶速度输入Y。如果您有若干个实验条件,则将第一个输入A列,第二个放入B列,依此类推。

此外,您也可以选择Prism的样本数据:酶动力学-Michaelis-Menten

输入数据后,单击“分析”,选择“非线性回归”,选择“酶动力学方程”面板,然后选择“Michaelis-Menten酶动力学”

模型

Y=Vmax*X/(Km+X)

解读参数

Vmax是单位与Y相同的最大酶速度。这是外推至极高底物浓度的酶速度,因此期值几乎始终高于实验中测定的任何速度。

Km是Michaelis-Menten常数,单位与X相同。其是达到最大酶速度一半所需的底物浓度。

创建Lineweaver-Burk图

在非线性回归可用之前,研究者必须将曲线数据变换成直线,进而可以使用线性回归进行分析。一种方法是使用Linewaver-Burk图,该作图法绘制了底物浓度的倒数与酶速度的倒数。

如果您创建Linewaver-Burk图,请仅使用其来显示您的数据。不要使用线性回归线的斜率和截距来确定Vmax和Km的值。如果您这样做,您将不会得到最准确的Vmax和Km值。问题是变换(倒数)扭曲了实验误差,因此双倒数作图法不符合线性回归的假设。使用非线性回归获得最精确的Km和Vmax值。

如需创建Lineweaver-Burk图(有相应线),首先需要记录非线性回归为Vmax和Km报告的值(我们稍后需要这些值)。首先,在包含数据的数据表中,单击工具栏中的“分析”按钮,从分析的“变换、归一化...”部分中选择“变换”,然后单击“确定”。在“函数列表”下拉菜单中,选择“药理学和生物化学变换”。选择“Lineweaver-Burk”选项,然后单击“确定”(确保选中“创建结果的新图表”复选框)。

现在,我们想在Lineweaver-Burk图中添加适当线。请勿简单地执行线性回归,因为这不会生成上述正确线。而是按以下步骤进行操作:

1.在变换数据的图表中,单击工具栏“分析”部分中的“分析”按钮

2.从分析的“生成曲线”部分中选择“绘制函数”,然后单击“确定”

3.在出现的对话框中,从“函数”选项卡上的函数列表中选择“直线”

4.使用“函数”选项卡底部的“X值范围”选项指定线的起点和终点

5.切换至“参数值和列标题”选项卡

6.计算1/Vmax,并输入该值作为Y截距(其中Vmax是先前通过非线性回归报告的值)

7.输入Km/Vmax作为斜率(其中Km和Vmax是先前通过非线性回归报告的值)

8.单击“确定”

9.Prism将生成标题为“绘制函数”的新数据表。单击并将此表拖到Lineweaver-Burk图表上,然后单击“添加”

注释

查看所有酶动力学分析的假设列表。

该方程精准拟合的曲线与拟合转换数Kcat(而非Vmax)的方程的曲线相同。  kcat乘以Et(酶位点的浓度)的乘积等于Vmax,因此如果您知道Et,则Prism可拟合Kcat。

该方程是变构酶方程的特例。变构模型增加了一项额外参数:Hill斜率h。当h等于1.0时,两个模型相同。

请注意,Km并非衡量酶和底物之间结合强度的结合常数。其值考虑了底物对酶的亲和力,以及将与酶结合的底物转化为产物的速率。

© 1995-2019 GraphPad Software, LLC. All rights reserved.