引言

解离结合实验测量放射性配体从受体解离的“解离率”。最初允许配体和受体结合，也许可达到平衡。在那时，您需要阻止放射性配体与受体的进一步结合，使得可测量解离速率。可通过多种方法做到：

•如果组织附着在表面上，可去除含有放射性配体的缓冲液，用没有放射性配体的新鲜缓冲液代替。

•旋转悬浮液并重新悬浮在新鲜缓冲液中。

•添加非常高浓度的未标记配体。如果该浓度足够高，它将立即与几乎所有未 占据的受体结合，从而阻断放射性配体的结合。

•用较大稀释因子稀释培养液，至少100倍。这将通过该因子降低放射性配体的浓度。在如此低的浓度下，放射性配体的新结合可忽略不计。该方法仅在使用相当低浓度的放射性配体时才实用，因此稀释后其浓度远低于其结合Kd。

然后，在此后的不同时间测量结合，以确定放射性配体从受体上脱落的速度。

循序渐进

创建一张XY数据表。将时间输入X，将总结合量输入Y。如果您有若干个实验条件，则将第一个输入A列，第二个放入B列，依此类推。

从特异性结合表中，单击“分析”，选择“非线性回归”，选择“动力学结合方程”窗格，然后选择 解离-单相指数衰减 。

模型

Y=Y0-NS*exp（-K*X）+NS

解读参数

Y0是时间零点的结合，以Y轴为单位。

NS是无限时间的结合（非特异性），以Y轴为单位。

K是速率常数，以X轴的倒数为单位。半衰期等于ln（2）除以K。

检查协同性

如果质量作用定律适用，配体与一个结合位点的结合不会改变另一个结合位点的亲和力。这也意味着配体从一个位点的解离不会改变配体从其他位点的解离。为验证这一假设，将无限稀释引发解离后的解离速率与加入大量未标记药物引发的解离速率进行比较。如果放射性配体与多个非相互作用的结合位点结合，则两种实验方案中的解离将是相同的，如下图所示。请注意，Y轴是用对数尺度显示。如果有一个单一的结合位点，则可期望解离数据在这张图上呈线性。有了两个结合位点，该图即使在对数轴上也弯曲。

右图显示了放射性配体以负协同性与相互作用结合位点结合时的理想解离数据。数据因解离的启动方式而不同。如果解离是由无限稀释引发的，则解离速率将随时间变化。一些放射性配体的解离会使剩余的配体结合得更紧密。通过加入冷药物来引发解离时，所有受体总是被配体占据（一些是热的，一些是冷的），且以其最高不变速率发生解离。