引言

您可以通过测量未标记配体与放射性配体的竞争性结合来确定其平衡解离常数。

步骤如下

创建 XY 数据表。在 X 列输入未标记化合物摩尔浓度的对数，在 Y 列输入结合情况。使用子列输入重复数据。

从数据表中单击 "分析"，选择非线性回归，选择竞争性结合方程面板，然后选择 "双位点 - 拟合 Ki"。

您必须根据实验设计将三个参数限制为常数：

•HotNM 是标记配体的浓度，单位为 nM。整个实验使用单一浓度的放射性配体。

•HotKdNMHi 是高亲和力位点的标记配体平衡解离常数，单位为 nM。

•HotKdNMLo 是低亲和力位点的标记配体平衡解离常数，单位为 nM。

模型

 

logEC50Lo=log(10^logKiLo*(1+HotNM/HotKdNMLo))

logEC50Hi=log(10^logKiHi*(1+HotNM/HotKdNMHi))

跨度=顶部 - 底部

Part1=FractionHi*Span/(1+10^(X-LogEC50Hi) )

Part2=(1-FractionHi)*Span/(1+10^(X-LogEC50Lo) )

Y= 底部 + 部分 1 + 部分 2

 

 

 

 

解读参数

顶部 和 底部 是以 Y 轴为单位的高原。

FractionHi是对竞争者具有高亲和力的所有位点的分数。

logKi_Hi和logKi_Lo是两个摩尔 Ki 值的对数。

注释

该模型直接拟合未标记配体的两个 log(Ki) 值。它不报告 IC50，因此您无需应用 Cheng 和 Prusoff 修正法(1)。您只需输入放射性配体的浓度及其 Kd 作为常数，Prism 就会直接拟合冷化合物的 Ki。如果您想拟合两个 IC50 值而不是 Ki 值，请使用不同的方程。

该分析假设您知道两个位点对标记配体的亲和力。在许多情况下，放射性配体对两个位点具有相同的亲和力。在这种情况下，只需输入两次该值即可。如果两个位点对标记配体的亲和力不同，则输入两个值（根据其他实验确定）。注意标签。常数 KdHi 是热配体对未标记配体亲和力高的受体的 Kd，KdLo 是热配体对未标记配体亲和力低的受体的 Kd。因此，KdHi 可能大于或小于 KdLo。

本分析假设结合是可逆的，并且处于平衡状态。还假设标记配体和未标记配体竞争相同的结合位点。

1.Cheng, Y. and Prusoff, W. H. inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction.Biochem Pharmacol, 22: 3099-3108, 1973.