引言

通过测量放射性配体结合的竞争，可确定未标记配体的平衡解离常数。

循序渐进

创建一张XY数据表。将未标记化合物的摩尔浓度的对数输入到X中，并结合到Y中。如果有几个实验条件，将第一个放入A列，第二个放入B列，依此类推。使用子列输入重复项。

在数据表中，点击“分析”，选择“非线性回归”，选择“竞争结合方程”窗格，然后选择双位点 - 拟合Ki。

根据您的实验设计，您必须将三项参数限制为常数值：

•HotNM是标记配体浓度（nM）。整个实验使用单一浓度的放射性配体。

•HotKdNMHi 是高亲和力位点标记配体的平衡解离常数（nM）。

•HotKdNMLo 是低亲和力位点标记配体的平衡解离常数（nM）。

模型

 

logEC50Lo=log（10^logKiLo*（1+HotNM/HotKdNMLo））

logEC50Hi=log（10^logKiHi*（1+HotNM/HotKdNMHi））

Span=Top - Bottom

Part1=FractionHi*Span/（1+10^（X-LogEC50Hi） ）

Part2=（1-FractionHi）*Span/（1+10^（X-LogEC50Lo） ）

Y=Bottom+Part1+Part2

 

 

 

 

解读参数

顶部 和底部均为以Y轴为单位的稳定段。

FractionHi是对竞争配体具有高亲和力的所有位点的分数。

logKi_Hi和logKi_Lo是两个摩尔Ki值的对数。

注意

该模型直接拟合未标记配体的两个log（Ki）值。它不报告IC50，因此无需应用Cheng和 Prusoff 修正（1）。取而代之的是，您输入放射性配体的浓度及其常数 Kd，Prism将直接拟合冷化合物的Ki。如需拟合两个IC50值而非Ki值，请使用不同方程。

分析假设已知两个位点对标记配体的亲和力。在许多情况下，放射性配体对两个位点具有相同亲和力。在此情况下，仅需输入该值两次。如果两个位点对标记配体具有不同亲和力，则输入两个值（由其他实验确定）。注意标签。常数KdHi是对未标记配体具有高亲和力的受体的热配体的Kd，KdLo是对未标记配体具有低亲和力的受体的热配体的Kd，因此KdHi可能比KdLo大或小。

该分析假设结合可逆且处于平衡状态。其还假设标记和未标记配体竞争相同结合位点。

1.Cheng, Y.和Prusoff, W. H.。抑制常数（K1）与对酶促反应产生50%抑制（I50）的抑制剂浓度之间的关系。《生化药理学》，22: 3099-3108，1973。